細(xì)菌性感染是臨床常見(jiàn)的感染類(lèi)型，其病原體（如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等）可引發(fā)肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、敗血癥等多種疾病，嚴(yán)重時(shí)危及生命。及時(shí)、準(zhǔn)確的病原體檢測(cè)是指導(dǎo)臨床合理用藥、降低并發(fā)癥發(fā)生率的關(guān)鍵。目前，臨床常用的細(xì)菌檢測(cè)方法以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為主，但該方法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)（24~48h）、靈敏度有限等缺陷，難以滿(mǎn)足急性細(xì)菌性感染的快速診斷需求。

酶標(biāo)儀作為酶聯(lián)免疫技術(shù)的核心檢測(cè)設(shè)備，憑借其自動(dòng)化程度高、檢測(cè)速度快、結(jié)可量化等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)領(lǐng)域。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀是針對(duì)免疫檢測(cè)優(yōu)化設(shè)計(jì)的設(shè)備，具備雙波長(zhǎng)檢測(cè)、多通道同步讀取、數(shù)據(jù)自動(dòng)分析等功能，理論上可提升病原體檢測(cè)的效率與準(zhǔn)確性。本研究通過(guò)建立基于該儀器的ELISA檢測(cè)體系，系統(tǒng)評(píng)估其在細(xì)菌性感染病原體檢測(cè)中的性能，為其科研轉(zhuǎn)化與臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、菌株來(lái)源：本研究選取6種臨床常見(jiàn)致病菌（金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、奇異變形桿菌ATCC 12453、表皮葡萄球菌ATCC 12228、糞腸球菌ATCC 29212）及3種非目標(biāo)菌株（白色念珠菌ATCC 10231、銅綠假單胞菌ATCC 27853、鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606），均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。

2、試劑：致病菌特異性單克隆抗體（抗金黃色葡萄球菌α-溶血素抗體、抗大腸桿菌O157抗原抗體等）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗、3,3',5,5'- 四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物液、封閉液（5%脫脂奶粉）；LB培養(yǎng)基、PBS緩沖液（pH7.4）由實(shí)驗(yàn)室自行配制。

3、儀器：博清生物酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)、超凈工作臺(tái)。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、菌株培養(yǎng)與樣本制備

將各致病菌接種于LB培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)12h后，用PBS緩沖液調(diào)整菌液濃度至10? CFU/mL，再通過(guò)梯度稀釋得到10?、10?、103、102、101CFU/mL的系列濃度菌液，作為檢測(cè)樣本；非目標(biāo)菌株按相同方法培養(yǎng)并制備成10?CFU/mL菌液，用于特異性驗(yàn)證。

2、ELISA 檢測(cè)體系建立

包被：將致病菌特異性單克隆抗體用包被緩沖液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至2μg/mL，每孔加100μL至96孔酶標(biāo)板，4℃孵育12h后，用PBST緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌3次，每次3min。

封閉：每孔加200μL 5%脫脂奶粉封閉液，37℃孵育1h，PBST洗滌3次。

加樣與孵育：每孔加100μL系列濃度菌液（空白對(duì)照加 PBS），37℃孵育1.5 h，PBST洗滌3次。

加酶標(biāo)二抗：將HRP標(biāo)記的二抗用封閉液稀釋至1:5000，每孔加100μL，37℃孵育1h，PBST洗滌5次。

顯色與終止：每孔加100μL TMB底物液，37℃避光孵育15min，隨后加50μL 2mol/L H?SO?終止反應(yīng)。

3、博清生物酶標(biāo)儀檢測(cè)參數(shù)設(shè)置

采用博清酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm（TMB顯色主峰），參考波長(zhǎng)為630nm（消除背景干擾），選擇“雙波長(zhǎng)差值”檢測(cè)模式，自動(dòng)讀取每孔吸光度值（OD???????）。以O(shè)D值≥0.2且大于空白對(duì)照OD值2倍判定為陽(yáng)性。

4、性能評(píng)估實(shí)驗(yàn)

重復(fù)性驗(yàn)證：選取103CFU/mL的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌菌液各1份，每份樣本平行檢測(cè)10次（批內(nèi)重復(fù)），連續(xù)檢測(cè)5d（批間重復(fù)），計(jì)算CV值（CV=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100%）。

特異性驗(yàn)證：檢測(cè)6種目標(biāo)致病菌（10?CFU/mL）及3種非目標(biāo)菌株（10?CFU/mL），記錄陽(yáng)性率，評(píng)估交叉反應(yīng)。

靈敏度驗(yàn)證：檢測(cè)系列濃度（101~10? CFU/mL）的目標(biāo)致病菌菌液，以陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)確定最低檢測(cè)限（LOD）。

檢測(cè)效率對(duì)比：分別采用博清酶標(biāo)儀ELISA法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)20份模擬感染樣本（含 103CFU/mL 目標(biāo)菌），記錄兩種方法的檢測(cè)周期及陽(yáng)性符合率。

二、結(jié)

（一）重復(fù)性結(jié)...

博清生物酶標(biāo)儀對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的批內(nèi)CV分別為2.8%、3.2%，批間CV分別為4.1%、4.5%，均小于5%，表明儀器檢測(cè)重復(fù)性良好。

（二）特異性結(jié)

6種目標(biāo)致病菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等）均檢測(cè)為陽(yáng)性，3種非目標(biāo)菌株（白色念珠菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌）均檢測(cè)為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)，特異性達(dá)100%。

（三）靈敏度結(jié)

博清生物酶標(biāo)儀對(duì)6種目標(biāo)致病菌的最低檢測(cè)限均為102 CFU/mL，而傳統(tǒng)培養(yǎng)法的最低檢測(cè)限為103CFU/mL，儀器靈敏度顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

（四）檢測(cè)效率對(duì)比

20份模擬感染樣本中，博清酶標(biāo)儀ELISA法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的陽(yáng)性符合率均為100%，但前者檢測(cè)周期僅為4~6h，后者需24~48h，檢測(cè)效率提升4~6倍。

三、討論

細(xì)菌性感染的早期診斷依賴(lài)于快速、準(zhǔn)確的病原體檢測(cè)技術(shù)。本研究針對(duì)博清生物酶標(biāo)儀的性能驗(yàn)證結(jié)表明，該儀器在細(xì)菌性感染病原體檢測(cè)中具有顯著優(yōu)勢(shì)：

1、高穩(wěn)定性與特異性：批內(nèi)、批間CV均小于5%，符合免疫檢測(cè)的重復(fù)性要求；且對(duì)非目標(biāo)菌株無(wú)交叉反應(yīng)，可有效避免誤診，這得益于儀器的雙波長(zhǎng)檢測(cè)模式——通過(guò)參考波長(zhǎng)（630nm）消除樣本濁度、酶標(biāo)板吸附差異等背景干擾，提升結(jié)準(zhǔn)確性。

2、高靈敏度與快速性：最低檢測(cè)限達(dá)102CFU/mL，優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，可檢測(cè)低濃度感染樣本，減少漏診；同時(shí)，檢測(cè)周期縮短至4~6h，解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)法“耗時(shí)久”的痛點(diǎn)，有助于臨床在感染早期啟動(dòng)針對(duì)性治療，降低抗生素濫用風(fēng)險(xiǎn)。

本研究仍存在局限性：樣本類(lèi)型僅覆蓋純菌液與模擬感染樣本，未納入臨床真實(shí)樣本（如血液、尿液），后續(xù)需進(jìn)一步驗(yàn)證儀器在復(fù)雜基質(zhì)中的檢測(cè)性能；此外，研究?jī)H針對(duì)6種常見(jiàn)致病菌，對(duì)耐藥菌株（如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA）的檢測(cè)適用性仍需拓展。

未來(lái)可結(jié)合核酸擴(kuò)增技術(shù)（如PCR）與博清酶標(biāo)儀的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)“核酸-免疫聯(lián)合檢測(cè)”體系，進(jìn)一步提升靈敏度；同時(shí)，優(yōu)化儀器的自動(dòng)化流程，實(shí)現(xiàn)樣本加樣、孵育、檢測(cè)的一體化，適配更多臨床樣本類(lèi)型，推動(dòng)其在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的普及應(yīng)用。

本研究通過(guò)重復(fù)性、特異性、靈敏度及檢測(cè)效率的系統(tǒng)評(píng)估，證實(shí)博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀在細(xì)菌性感染病原體檢測(cè)中具有穩(wěn)定、特異、靈敏、快速的核心優(yōu)勢(shì)，可滿(mǎn)足科研階段的致病菌篩查需求，并為臨床細(xì)菌性感染的早期診斷提供可靠的技術(shù)支持，具有較高的應(yīng)用價(jià)值與轉(zhuǎn)化潛力。